1. 실험의 목적

세균을 대량 배양할 때나 또는 조사해야 할 시료으 숫자가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정해 볼 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 구해 보고 또 정확한 균체수의 측정을 위해서 콜로니 계수법을 병행해 보도록 한다.

2. 실험의 원리

이 방법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수(혹은 산란)시킬 수가 있고, 이때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. <그림4-1>은 흡광계(Photocolorimetry)에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색 광은 회절격(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사할 수가 있다. 시료를 투과한 빛은 광전관(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료 속의 균체 수에 반비례한다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, O.D.)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세포 수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해 놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체 수를 알아낼 수 있을 것이다.

3. 실험 재료 및 방법

<재료>

(1) 균주: Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양).

(2) 배지: LB broth 배지(실험3-2참조), LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15g/l첨가).

(3) 기구 및 시약: 분광광도계, 무균대, 멸균된 피펫, 멸균된 빈 시험관(희석용), 멸균된 증류수.

<방법>

(1) 멸균된 상태의 배지 100ml에 E. coli 배양액 1ml를 접종하여 키운다(37℃, 200rpm).

(2) 접종 후 4시간 동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 다음 과 같이 흡광도 측정 및 콜로니 계수법을 수행한다.

① 시간별로 시료를 채취하여 흡광도(파장은 595nm 또는 600nm)를 잰다. 0 time에서의 O.D.₆₀₀은 0.08-0.1로부터 출발하는게 적당하다. 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프 용지를 사용하여 그려 보고 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접적으로 구해 본다. Generation time은 흡광도의 변화가 2배가 될 때까지 걸리는 시간이다.

② 시간별로 시료 약 1ml를 채취하여 멸균된 증류수로 10^-5, 10^-7 및 10^-9로 희석을 한다. 희석된 시료 200 μl 씩을 미리 준비한 LB평판배지 3장식에 접종한 후에 37℃배양기에서 하룻밤 배양한다. 다음날 자라난 콜로니 숫자를 세어 시료 1ml당 세균 수를 배양시간 별로 구한다(세 종류의 희석배수 중에서 콜로니 숫 자가 너무 많아서 셀 수가 없거나 또는 너무 적은 경우에는 제외한다).

* 각 시간별 특정 희석배수에서의 시료 1ml당 세균수= (전체 콜로니 숫자÷3)×5×희석배수

4. 실험 수행상 주의할 점

(1) 시간별로 시료를 채취할 때 반드시 무균조작을 하도록 하고, 채취가 끝난 배지는 바로 배양기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.

(2) 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용할 때는 충분히 예열을 해야 하며 반드시 멸균된 동일 배지로 영점조정을 한 후에 사용한다.

5. 고찰

(1) 배양 시간에 따른 세균수의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지를 사용하여 그려 보고 Generation time(GT)을 직접 구해 본다.

GT=t log2 / (log A - log B)

여기서 B = 대수생장기에서 한 시점에서의 세균 수

       A = 대수생장기에서 두 번째 시점에서의 세균 수

       t = A, B 두 시점 사이의 시간

(2) 흡광도 측정 및 콜로니 계수법의 두 가지 방법으로 구한 Generation time을 비교해 보고, 또 대수기에서의 흡광도와 균체수의 상관관계를 그려 본다.

6. 참고 문헌

(1) Benson, H.J., microbiological applications, 6th ed., 1994, p. 87.

(2) Cappuccino, J.G. and N. Sherman, Microbiology - a laboratory manual, 3rd ed., 1992, p. 117.